In zunehmendem Maße suchen Arzneimittelentwickler große Moleküle und insbesondere Proteine ​​als eine therapeutische Option. Die Formulierung eines Proteinarzneistoffprodukts kann eine ziemliche Herausforderung sein, aber ohne ein gutes Verständnis der Natur der Proteinstruktur und der Konformationseigenschaften des spezifischen Proteins, das formuliert wird, können die Ergebnisse ruinös sein. Diese technische Aufgabe soll dem Leser einen schnellen Überblick über die Proteinstruktur geben. Es wird auch kurz behandelt, wie die Proteinstruktur während der Formulierung beeinflusst werden kann, und einige der analytischen Methoden, die sowohl zur Bestimmung der Struktur als auch zur Analyse der Stabilität des Proteins verwendet werden können.

Die Ausdrucksstruktur , wenn sie in Bezug auf Proteine ​​verwendet wird, hat eine viel komplexere Bedeutung als für kleine Moleküle. Proteine ​​sind Makromoleküle und haben vier verschiedene Strukturniveaus – primär, sekundär, tertiär und quaternär.

Primärstruktur

Es gibt 20 verschiedene Standard-L-α-Aminosäuren, die von Zellen für den Proteinaufbau verwendet werden. Aminosäuren, wie ihr Name andeutet, enthalten sowohl eine basische Aminogruppe als auch eine saure Carboxylgruppe. Diese Difunktionalität erlaubt es den einzelnen Aminosäuren, durch Bildung von Peptidbindungen lange Ketten miteinander zu verbinden:Amidbindungen zwischen dem -NH2 einer Aminosäure und dem -COOH eines anderen. Sequenzen mit weniger als 50 Aminosäuren werden im Allgemeinen als Peptide bezeichnet , während die Ausdrücke Protein oder Polypeptid für längere Sequenzen verwendet werden. Ein Protein kann aus einem oder mehreren Polypeptidmolekülen bestehen. Das Ende der Peptid- oder Proteinsequenz mit einer freien Carboxylgruppe wird als Carboxyterminus oder C-Terminus bezeichnet. Die Begriffe Amino-Terminus oder N-Terminus beschreiben das Ende der Sequenz mit einer freien α-Aminogruppe.

Die Aminosäuren unterscheiden sich in der Struktur durch den Substituenten an ihren Seitenketten. Diese Seitenketten verleihen dem endgültigen Peptid oder Protein verschiedene chemische, physikalische und strukturelle Eigenschaften. Die Strukturen der 20 Aminosäuren, die üblicherweise in Proteinen gefunden werden, sind in 1 gezeigt. Jede Aminosäure hat sowohl eine Ein-Buchstaben- als auch Drei-Buchstaben-Abkürzung. Diese Abkürzungen werden üblicherweise verwendet, um die geschriebene Sequenz eines Peptids oder Proteins zu vereinfachen.

Abhängig vom Seitenketten-Substituenten kann eine Aminosäure als sauer, basisch oder neutral klassifiziert werden. Obwohl 20 Aminosäuren für die Synthese verschiedener Proteine ​​benötigt werden, die beim Menschen gefunden werden, können wir nur 10 synthetisieren. Die restlichen 10 werden essentielle Aminosäuren genannt und müssen in der Nahrung erhalten werden.

Die Aminosäuresequenz eines Proteins ist in DNA kodiert. Proteine ​​werden durch eine Reihe von Schritten synthetisiert, die als Transkription bezeichnet werden (die Verwendung eines DNA-Stranges zur Herstellung eines komplementären Messenger-RNA-Stranges – mRNA) und Translation (die mRNA-Sequenz wird als Vorlage zur Synthese der Kette von Aminosäuren verwendet, die sie bilden up das Protein). Oft treten posttranslationale Modifikationen wie Glykosylierung oder Phosphorylierung auf, die für die biologische Funktion des Proteins notwendig sind. Während die Aminosäuresequenz die Primärstruktur des Proteins bildet, hängen die chemisch / biologischen Eigenschaften des Proteins stark von der Dreidimensionalität oder Tertiärstruktur ab.

Sekundärstruktur

Stränge oder Stränge von Proteinen oder Peptiden weisen unterschiedliche charakteristische lokale strukturelle Konformationen oder Sekundärstrukturen auf , abhängig von der Wasserstoffbindung. Die zwei Haupttypen der Sekundärstruktur sind die α-Helix und das β-Faltblatt.

Die α-Helix ist ein rechtsgerollter gewundener Strang. Die Seitenkettensubstituenten der Aminosäuregruppen in einer α-Helix erstrecken sich nach außen. Wasserstoffbrücken bilden sich zwischen dem Sauerstoff des C = O jeder Peptidbindung im Strang und dem Wasserstoff der NH-Gruppe der Peptidbindung vier Aminosäuren darunter in der Helix. Die Wasserstoffbrücken machen diese Struktur besonders stabil. Die Seitenketten-Substituenten der Aminosäuren passen neben die NH-Gruppen.

Die Wasserstoffbindung in einem ß-Faltblatt liegt zwischen den Strängen (Zwischenstrang) und nicht innerhalb der Stränge (Intratrang). Die Plattenkonformation besteht aus Paaren von Strängen, die Seite an Seite liegen. Die Carbonyloxygen in einer Strang-Wasserstoff-Bindung mit den Amino-Wasserstoffatomen des benachbarten Stranges. Die zwei Stränge können entweder parallel oder antiparallel sein, abhängig davon, ob die Strangrichtungen (N-Terminus bis C-Terminus) gleich oder entgegengesetzt sind. Das antiparallele ß-Faltblatt ist aufgrund der besser ausgerichteten Wasserstoffbrücken stabiler.

Tertiärstruktur

Die gesamte dreidimensionale Form eines gesamten Proteinmoleküls ist die Tertiärstruktur . Das Proteinmolekül wird sich so biegen und verdrehen, dass maximale Stabilität oder niedrigster Energiezustand erreicht wird. Obwohl die dreidimensionale Form eines Proteins unregelmäßig und zufällig erscheinen mag, wird es durch viele stabilisierende Kräfte aufgrund von Bindungswechselwirkungen zwischen den Seitenkettengruppen der Aminosäuren gebildet.

Unter physiologischen Bedingungen neigen die hydrophoben Seitenketten neutraler, nichtpolarer Aminosäuren wie Phenylalanin oder Isoleucin dazu, im Inneren des Proteinmoleküls vergraben zu sein, wodurch sie vor dem wässrigen Medium geschützt werden. Die Alkylgruppen von Alanin, Valin, Leucin und Isoleucin bilden häufig hydrophobe Wechselwirkungen untereinander, während aromatische Gruppen wie die von Phenylalanin und Tryosin häufig zusammenstapeln. Saure oder basische Aminosäureseitenketten werden im Allgemeinen auf der Oberfläche des Proteins exponiert sein, da sie hydrophil sind.

Die Bildung von Disulfidbrücken durch Oxidation der Sulfhydrylgruppen an Cystein ist ein wichtiger Aspekt der Stabilisierung der Protein-Tertiärstruktur, wodurch verschiedene Teile der Proteinkette kovalent zusammengehalten werden können. Zusätzlich können sich Wasserstoffbrücken zwischen verschiedenen Seitenkettengruppen bilden. Wie bei Disulfidbrücken können diese Wasserstoffbrücken zwei Teile einer Kette zusammenführen, die hinsichtlich der Sequenz in einiger Entfernung liegen. Salzbrücken , ionische Wechselwirkungen zwischen positiv und negativ geladenen Stellen auf Aminosäureseitenketten, helfen ebenfalls, die Tertiärstruktur eines Proteins zu stabilisieren.

Quartäre Struktur

Viele Proteine ​​bestehen aus mehreren Polypeptidketten, die oft als Proteinuntereinheiten bezeichnet werden . Diese Untereinheiten können gleich (wie in einem Homodimer) oder verschieden sein (wie in einem Heterodimer). Die Quartärstruktur bezieht sich darauf, wie diese Proteinuntereinheiten miteinander wechselwirken und sich selbst so anordnen, dass sie einen größeren Aggregatproteinkomplex bilden. Die endgültige Form des Proteinkomplexes wird erneut durch verschiedene Wechselwirkungen stabilisiert, einschließlich Wasserstoffbrückenbindung, Disulfidbrücken und Salzbrücken. Die vier Ebenen der Proteinstruktur sind in 2 gezeigt.

Proteinstabilität

Aufgrund der Art der schwachen Wechselwirkungen, die die dreidimensionale Struktur steuern, sind Proteine ​​sehr empfindliche Moleküle. Der Begriff nativer Zustand wird verwendet, um das Protein in seiner stabilsten natürlichen Konformation in situ zu beschreiben. Dieser native Zustand kann durch eine Anzahl äußerer Streßfaktoren gestört werden, einschließlich Temperatur, pH-Wert, Entfernung von Wasser, Vorhandensein von hydrophoben Oberflächen, Anwesenheit von Metallionen und hoher Scherung. Der Verlust der sekundären, tertiären oder quaternären Struktur aufgrund der Exposition gegenüber einem Stressfaktor wird als Denaturierung bezeichnet. Die Denaturierung führt zur Entfaltung des Proteins in eine zufällige oder fehlgefaltete Form.

Ein denaturiertes Protein kann ein ziemlich anderes Aktivitätsprofil aufweisen als das Protein in seiner nativen Form, wobei es normalerweise seine biologische Funktion verliert. Zusätzlich zur Denaturierung können Proteine ​​unter bestimmten Stressbedingungen auch Aggregate bilden. Aggregate werden oft während des Herstellungsprozesses produziert und sind typischerweise unerwünscht, hauptsächlich aufgrund der Möglichkeit, dass sie bei der Verabreichung nachteilige Immunantworten verursachen.

Zusätzlich zu diesen physikalischen Formen des Proteinabbaus ist es auch wichtig, sich der möglichen Wege des chemischen Abbaus von Proteinen bewusst zu sein. Diese umfassen Oxidation, Desamidierung, Peptidbindungshydrolyse, Disulfidbindungsumlagerung und -vernetzung. Die Verfahren, die bei der Verarbeitung und Formulierung von Proteinen verwendet werden, einschließlich eines beliebigen Gefriertrocknungsschritts, müssen sorgfältig untersucht werden, um einen Abbau zu verhindern und die Stabilität des Proteinbiopharmazeutikums sowohl bei der Lagerung als auch während der Arzneimittelabgabe zu erhöhen.

Proteinstrukturanalyse

Die Komplexitäten der Proteinstruktur machen die Aufklärung einer vollständigen Proteinstruktur selbst mit den modernsten analytischen Geräten extrem schwierig. Ein Aminosäureanalysator kann verwendet werden, um zu bestimmen, welche Aminosäuren vorhanden sind und welche Molverhältnisse jeweils vorliegen. Die Sequenz des Proteins kann dann mittels Peptidkartierung und der Verwendung von Edman-Abbau oder Massenspektroskopie analysiert werden. Dieser Prozess ist eine Routine für Peptide und kleine Proteine, wird aber für große multimere Proteine ​​komplexer.

Die Peptidkartierung beinhaltet im Allgemeinen die Behandlung des Proteins mit verschiedenen Proteaseenzymen, um die Sequenz an spezifischen Spaltungsstellen in kleinere Peptide aufzuteilen. Zwei häufig verwendete Enzyme sind Trypsin und Chymotrypsin. Die Massenspektroskopie ist zu einem unschätzbaren Werkzeug für die Analyse von Enzym-verdauten Proteinen geworden, mittels Peptid-Fingerprinting-Verfahren und Datenbanksuche. Edman-Abbau beinhaltet die Spaltung, Trennung und Identifizierung von jeweils einer Aminosäure ausgehend von einem kurzen Peptid ausgehend vom N-Terminus.

Eine Methode zur Charakterisierung der Sekundärstruktur eines Proteins ist die Circulardichroismus-Spektroskopie (CD). Die verschiedenen Arten der Sekundärstruktur, α-Helix, β-Faltblatt und Random-Coil, haben alle charakteristische Circulardichroismus-Spektren im Fern-UV-Bereich des Spektrums (190-250 nm). Diese Spektren können verwendet werden, um den Anteil des gesamten Proteins, der aus jedem Strukturtyp besteht, anzunähern.

Eine vollständigere, hochauflösende Analyse der dreidimensionalen Struktur eines Proteins wird mittels Röntgenkristallographie oder Kernspinresonanz (NMR) -Analyse durchgeführt. Um die dreidimensionale Struktur eines Proteins durch Röntgenbeugung zu bestimmen, ist ein großer, geordneter Einkristall erforderlich. Die Röntgenbeugung ermöglicht die Messung der kurzen Atomabstände und liefert eine dreidimensionale Elektronendichtekarte, aus der sich ein Modell der Proteinstruktur aufbauen lässt.

Die Verwendung von NMR zur Bestimmung der dreidimensionalen Struktur eines Proteins hat einige Vorteile gegenüber der Röntgenbeugung, da es in Lösung durchgeführt werden kann und somit das Protein frei von den Beschränkungen des Kristallgitters ist. Die zweidimensionalen NMR-Techniken, die allgemein verwendet werden, sind NOESY, das die Abstände zwischen Atomen durch den Raum misst, und COESY, das Abstände durch Bindungen misst.

Proteinstrukturstabilitätsanalyse

Viele verschiedene Techniken können verwendet werden, um die Stabilität eines Proteins zu bestimmen. Zur Analyse der Entfaltung eines Proteins können spektroskopische Methoden wie Fluoreszenz, UV, Infrarot und CD verwendet werden. Thermodynamische Methoden wie die Differential Scanning Calorimetry (DSC) können bei der Bestimmung der Auswirkung der Temperatur auf die Proteinstabilität nützlich sein. Vergleichende Peptid-Mapping (in der Regel unter Verwendung von LC / MS) ist ein äußerst wertvolles Werkzeug bei der Bestimmung chemischer Veränderungen in einem Protein wie Oxidation oder Deamidierung. HPLC ist auch ein unschätzbares Mittel zur Analyse der Reinheit eines Proteins. Andere analytische Methoden wie SDS-PAGE, isoelektrische Fokussierung und Kapillarelektrophorese können ebenfalls verwendet werden, um die Proteinstabilität zu bestimmen, und ein geeigneter Bioassay sollte verwendet werden, um die Wirksamkeit eines Proteinbiopharmazeutikums zu bestimmen.

Die Vielzahl von Methoden zur Bestimmung der Proteinstabilität unterstreicht erneut die Komplexität der Art der Proteinstruktur und die Wichtigkeit, diese Struktur für ein erfolgreiches biopharmazeutisches Produkt aufrechtzuerhalten.

Verweise

  1. 1. Proteinstruktur, Stabilität und Faltung, Methoden in der Molekularbiologie, Vol. 168, Herausgegeben von Kenneth P. Murphy
  2. 2. Proteinstabilität und -faltung, Theorie und Praxis, Methoden in der Molekularbiologie, Vol. 40, herausgegeben von Bret A. Shirley